1927年7月，恽代英被中共临时中央派赴九江，后转赴南昌。7月24日，中共中央在武汉召开临时中央常委会，恽代英与周恩来、李立三、彭湃、谭平山等5人组成起义前敌委员会，分析敌我形势，确定起义的时间、地点、起义部队、组织机构、行动计划和作战部署。
南昌起义爆发前，张国焘赶到九江传达所谓“国际来电”，企图阻止起义，遭到恽代英等的强烈反对，恽代英主张必须依靠共产党人已经确定的武装力量，进行独立军事行动，并愤怒地对张国焘说：“现在南昌一切准备好了，忽然又来了什么国际指示，阻止我们的行动，我是誓死反对的。”“如果你再动摇人心，就要打倒你。”
南昌起义胜利后，恽代英任革命委员会委员、主席团委员及代理宣传委员会主任。8月1日，在恽代英的布置下，《宣传大纲》以及重要的标语口号已散发到各处，负责演讲做群众工作的宣传队，已深入到南昌城内的大街小巷，系着红领巾的起义军巡逻队步伐威武地在热闹的市区巡逻。
8月2日，恽代英在南昌市组织了5万人参加的“庆祝革命委员会成立和军民联欢大会”，并在会上慷慨陈词，阐述了“为了挽救革命，反对国民党大屠杀的武装起义的总方针”，“斗志昂扬地鼓励士兵和群众，为推翻国民党的反革命统治，捍卫工农阶级的利益，建立革命政权，必须紧紧地把枪杆子握在手中。”
南昌起义胜利后，起义军按原计划撤离南昌开始南征。恽代英忙着做政治思想教育和宣传工作，“每到行军休息时，他总是和战士们一起，给战士们做思想工作，宣传革命必胜，鼓动战士们英勇奋战。”面对南征途中各种困难，恽代英从未说一声劳累困苦，并且还经常鼓励战士们：“革命本非享福与畏难的人干的事。”行军途中，他引导战士们齐声高唱，解除行军疲劳。恽代英与士兵同甘共苦，用自己的行动感染大家，提升战士的革命激情。恽代英身患肺病，组织上照顾配给他一匹马，但他总是把马让给有病的或体弱的同志骑，自己穿着一套粗布军衣，扛着背包，肩上搭着一条长布手巾，与战士们一起步行。
起义军在抚州、广昌、瑞金、长汀、上杭、汕头等停留时间较长的城市里，都组织群众集会，每次都有恽代英讲话。他向渴求解放的群众分析国内外政治形势，解释革命军的目的和政策。恽代英的讲话通俗易懂，使群众很容易接受。（贾晓明）